Dilahirkan di Desa Jaten, Surakarta kepada KPH Soemohardjoo dan Raden Ayu Hatmanti Soemohardjo, Siti Hartinah merupakan anak kedua antara sepuluh orang adik beradik. Sebagai keturunan Pangeran Mangkunagara III yang keempat., beliau juga merupakan seorang bangsawan.

Masa kecil Siti Hartinah diwarnai dengan berpindah-pindah tempat tinggal mengikuti bapanya yang bertugas sebagai seorang pegawai rendah dalam perkhidmatan awam. Ketika berumur tiga tahun, bapanya dipindahkan ke Jumapolo, sebuah kota kecamatan di Karanganyar, sekitar 26 kilometer dari Kota Solo. Di kota ini, Siti Hartinah nyaris-nyaris dikorbankan oleh wabak disenteri yang melanda Jumapolo. Sebagai tempat yang terpencil, Jumapolo tidak memiliki sebarang kemudahan perubatan, mahupun jururawat. Oleh itu, Siti Hartinah terpaksa menunggu nasib kerana tiada orang lain yang berani mendekatinya kecuali kedua-dua orang tuanya. Walaupun demikian, beliau pulih daripada penyakitnya.

Ketika berumur lima tahun, bapa Siti Hartinah dipindahkan ke Matesih, Kabupaten Karanganyar di kaki Gunung Lawu. Di sinilah, Siti Hartinah memulakan pendidikan formalnya di sebuah sekolah rendah yang hanya menawarkan dua tahun pendidikan.

Abdul Rachman, sahabat bapa Siti Hartinah, hendak mengambil anak angkat kerana walaupun beliau sudah berumah tangga, namun beliau tidak mempunyai anak. Pilihannya jatuh pada Siti Hartinah. Meskipun berat hati, selepas dirundingkan, akhirnya Siti Hartinah mengikut keluarga barunya ke Kota Solo. Di sana, beliau menyertai Sekolah Hollandsch-Inlandsche (HIS), sebuah sekolah elit yang mengamalkan sistem pendidikan Belanda.

Sayangnya, baru setahun selepas bersama dengan keluarga Abdul Rachman yang begitu menjaganya, Siti Hartinah terpaksa kembali ke keluarga ibu bapa kandungnya kerana menghidap penyakit cacar yang sangat merisaukan. Semasa itu, bapanya sudah berpindah dari Matesih ke Kerjo. Selepas sembuh, Siti Hartinah kembali bersekolah di sebuah sekolah rendah yang ada di desa itu.

Semasa di Kerjo, bapa Siti Hartinah dinaikkan pangkat menjadi wedana, ketua wilayah kawedanan. Pada tahun 1933 ketika berusia 10 tahun, Siti Hartinah berpindah sekali lagi bersama-sama keluarganya ke Wonogir dan di sana, menyertai Darjah 3 di HIS.

Siti Hartinah berjaya menyelesaikan persekolahannya di HIS, tetapi tidak dapat melanjutkan pendidikannya. Ayahnya menjadi wedana Wonogiri hanya selama lima tahun dan kemudian dipindahkan menjadi wedana Wuryantoro. Dua tahun kemudian, beliau pun bersara. Oleh itu, Siti Hartinah menghabiskan masanya untuk membuat batik, dengan hasilnya dijual untuk membiayai kursus menaip serta ilmu trengkas.